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TU Berlin

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Die 10 wichtigsten Publikationen

1

Budisa, N., Minks, C., Medrano, F. J., Lutz, J., Huber, R., Moroder, L. (1998). Residue-specific bio-incorporation of non-natural biologically active amino acids into proteins as possible drug carriers. Structure and stability of per-thiaproline mutant or annexin V.
Proc. Acad. Sci., USA 95, 455-459
.

Protein-basiertes Drug-Delivery-Engineering: Lieferung eingebauter Medikamente in ein Zielgewebe.
  "Das ist eine sehr schöne Arbeit", meint Peter G. Schultz von der Universität von Kalifornien in Berkeley. "Es handelt sich um eine neue Anwendung für den Einbau von Aminosäure-Analoga in Proteine."  
Siehe:Link 
  “Anstatt in einer Pille verpackt zu sein, kann eine spezielle Klasse von Medikamenten als Teil des Baugerüsts eines Proteins in den Körper eingeschleust werden, behauptet eine aktuelle Studie. Durch Auswahl eines geeigneten Proteins als Träger sind Wissenschaftler in der Lage, diese Medikamente zu spezifischen Geweben zu senden oder sogar die Zeit ihrer Freigabe zu bestimmen. Die Forscher (....) bewiesen die Durchführbarkeit dieser Idee durch Synthese eines Proteins, in dem eine natürliche Aminosäure mit einer nicht-natürlichen, biologisch aktiven ersetzt wurde. Laut ihrer Theorie würde das modifizierte Protein im Inneren des Körpers wie sein natürliches Gegenstück zu den Zielzellen reisen und dann den Wirkstoff - eine Nicht-Standard-Aminosäure - abliefern.“ (Von: "Built-in drugs could target tissues." The Free Library. 1998 Science Service, Inc.). Wir entwickelten diese Idee weiter und publizierten zwei Jahre später weitere Details (Tetrahedron, 2000, 56, 9431-9442;In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation”).


2

Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. (2001). Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 923-925.

Entdeckung der Rolle von Prolin-Puckering in der Proteinfaltung und Translation.
  Hier meldeten wir den ersten in-vivo-Einbau von fluorierten Prolinen in ein rekombinantes Protein. Diese Studie bestätigte unsere Erwartung, dass eine direkte Korrelation zwischen der Faltung des biosynthetisierten Proteins und den Konformationseigenschaften eingebauter Prolinanaloga (z.B. cis / trans-Verhältnis, pKa-Werte, Pyramidalisierung der Carbonylgruppe usw.) vorhanden sein muss. In den folgenden Jahren weiteten wir unsere Studien auf andere Proteinen aus. Im Jahr 2008 veröffentlichten wir die Entdeckung eines „supergefalteten“, grün fluoreszierenden Proteins zusammen mit seiner hochaufgelösten dreidimensionalen Struktur (link), die uns zur Entdeckung der Rolle des Prolin-Puckering für die allgemeine Proteinfaltung führte. Dabei stellten wir fest, dass Prolin-Puckering eine neue Dimension/ein neuer Parameter in unserem Verständnis der Proteinfaltung ist. Dieses Prolin-Puckering ist im Rahmen von n-zu-pi*-Wechselwirkungen zu verstehen. Zuletzt erweiterten wir diese Studien zum in-vivo-Einbau synthetischer Pro-Analoga in Pro-reiche Sequenzen und fanden dabei heraus, dass der in-vivo-Einbau stark abhängig von der stereo-chemischen Natur der verwendeten Prolinanaloga ist (link). Dies führt uns zur aktuellen Forschung über die grundlegenden chemischen Mechanismen hinter der Proteinbiosynthese mit Oligo-Prolinsequenzen.
 
3

Bae, J., Rubini, M., Jung, G., Wiegand, G., Seifert, M. H. J., Azim, M. K., Kim, J. S., Zumbusch, A., Holak, T. A., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. (2003). Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins.
J. Mol. Biol. 328, 977-1202.

Siehe auch: Lepthien, S., Hoesl, M. G., Merkel, L., Budisa, N. (2008). Azatryptophans endow proteins with intrinsic blue fluorescence.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.105, 16095-16100.


"Gold" aus "Türkis": Engineering einer neuen "goldenen" Klasse von synthetischen Autofluoreszenzproteinen; Versuche zum Design von intrinsisch farbigen Proteinen.
   Hier berichteten wir über das spektakuläre Engineering eines "gold-fluoreszierenden Proteins", das eine neue Klasse von durch Einbau nicht-kanonischer Aminosäuren erzeugten synthetischen, auto-fluoreszierenden Proteinen repräsentiert. Es ist das am weitesten nach Rot verschobene GFP-Protein (Emax bei 576 nm) unter allen von Aequorea victoria abgeleiteten Varianten und Mutanten. Darüber hinaus führten wir GFP als Modellprotein in das Forschungsfeld ein. Heute ist es das am häufigsten verwendete Modellprotein für Monitoring und Analyse des Einbaus nicht-kanonischer Aminosäuren.
 
4

Wolschner, C., Giese, A., Kretzschmar, H., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. (2009). Design of anti- and pro-aggregation variants to assess the effects of methionine oxidation in human prion protein.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7756-7761.

In diesem Beitrag berichteten wir zum ersten Mal von einem chemischen Modell, das zeigte, dass die Methioninoxidation einer der Hauptgründe für die Konformationsänderung im Prion-Protein bei oxidativem Stress sein könnte. Die Verwendung der nicht-kanonischen Aminosäuren Norleucin (Nle) und Metoxinin (Mox) als Methionin Analoga haben diese Erkenntnis ermöglicht. In Zusammenarbeit mit der Kretschmar Gruppe der LMU München gelang es uns den chemischen Einfluss der Met-Seitenkette in der Pathogenese der Prionkrankheiten zu untersuchen. Überraschenderweise zeigte sich, dass die Methioninoxidation und der oxidativer Stress eng miteinander verknüpft sind. Wir entwickelten ein chemisches Modell, das zur Gestaltung eines entweder aggregations-resistenten oder aggregations-anfälligen Prion-Proteins führte. Durch den getrennten Einbau von Nle und Mox konnten wir stichhaltige Daten sammeln, die die Hypothese, dass  Methioninoxidation einer der Hauptgründe für die Konformationsänderung im Prion-Protein sein könnte, bestätigen. (Weitere Details finden Sie unter ‚News‘ aus dem Jahr 2009 auf unserer Website)


5

Hoesl, M. G., Acevedo Rocha, C., Nehring, S., Wolschner, C., Royter, M., Wiltschi, B., Budisa, N., Antranikian, G. (2011). Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering.
ChemCatChem, 3, 213-221.
 
 
Mit dieser Arbeit waren wir die Ersten, die die praktische Bedeutung der Inkorporation von nicht kanonischen Aminosäuren (nkASs) für die Biokatalyse systematisch zeigen konnten. Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie, wurde die Enzymoptimierung durch rationelle und gerichtete Evolutionsansätze die dominierende Route zur Erzeugung von Sequenzdiversität. Jedoch ist die Aufgabe der Identifizierung von vorteilhaften Diversitäten nicht trivial und Mutationen, die die gesamte Struktur des Enzyms umfassen, haben normalerweise schädliche Auswirkungen. Die gerichtete Evolution lässt sich mit der Suche nach der Nadel im Heuhaufen vergleichen, Milliarden von Varianten müssen auf DNA-Ebene erzeugt werden und anschließend nach ihrer Funktionalität sortiert werden, um eventuell eine gewünschte Eigenschaft hervorzubringen. In diesem Zusammenhang, könnte der Einbau von nkASs zu einer größeren chemischen Vielfalt in den Proteinen führen. Daher könnte Selektionsdruckeinbaumethode (SPI) Methode eine alternative Technologie sein, die das Potential hat, die traditionellen Ansätze im Biokatalyse-Design zu ergänzen und eventuell sogar zu ersetzen.  
 
6

Budisa, N. (2013). Expanded genetic code for the engineering of ribosomally synthetized and post-translationally modified peptide natural products (RiPPs)
Curr. Opin. Biotechnol. 24, 591-598.
 
 
Die rekombinante Expression von peptid-basierten Wirkstoffen mit nkASs (in verschiedenen Kombinationen ihrer Anzahl und chemischen Eigenschaften) wird die Lantibiotika-Strukturen wesentlich diversifizieren und neue, einzigartige Sequenzkombinationen hervorbringen. Unter diesen sind diejenigen mit besonderen Eigenschaften wichtig für die therapeutische Verwendung (Peptid-Antibiotika stehen nicht nur wegen ihrer antibakteriellen Eigenschaften im Blickpunkt vieler Pharmaunternehmen). Unmittelbar nach dem Umzug nach Berlin begannen wir mit der Gruppe von Prof. Dr. R. Süssmuth zusammen zu arbeiten. Der Fokus dieser Zusammenarbeit liegt auf dem Einbau von verschiedenen nkASs in ribosomal-synthetisierten Lantibiotika (10.1002/cbic.201402558; 10.1002/anie.201106154). Dabei zeigten wir erstmals, dass die physikalischen Eigenschaften vieler nkASs die chemischen und funktionellen Eigenschaften der Lantibiotika direkt beeinflussen können. Somit erreichten wir eine weitere Stufe der chemischen Diversifizierung der Lantibiotika Struktur in bakteriellen Zellen. Dieses hat eine große Bedeutung für die Entwicklung von neuen und einzigartigen, aktiven Peptide mit verbesserter Spezifität, Stabilität, Membrandurchlässigkeit und oraler Verfügbarkeit. Weitere Versuche beruhend auf ko-translationaler Einbau verschiedener unnatürliche bzw. synthetische Aminosäuren würde sicherlich die Zahl der möglichen chemischen Kombinationen in der Peptid-basierten antibiotischen Gestaltung weiter erhöhen.  
 
7

Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. (2010). In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 5446-5450.
 
 
Der Anfang unsere wissenschaftlichen Aktivität war durch verschiedene Versuche geprägt zahlreiche Methionin- und Tryptophan-Analoga in Proteine einzubauen. Die erzeugten Proteinderivaten waren in erster Linie für die Proteinstrukturaufklärung mittels Röntgenstrukturanalyse gedacht. Im laufe der Zeit erweiterten wir unseren Ansatz auf andere Forschungsbereiche. Im Jahr 2010 erreichen wir einen wichtigen Meilenstein in der Weiterentwicklung unserer Selektionsdruckeinbaumethode (SPI): Wir berichteten über den ersten gleichzeitigen Einbau von drei chemisch unterschiedliche Aminosäure in ein rekombinantes Protein (in einem einzelnen Expression- Inkorporationsexperiment). In der folgenden wissenschaftlichen Arbeit konnten wir beweisen, das wir nun in der Lage sind, eine effiziente in vivo Neuzuordnung  entweder durch die Verwendung von vier verschiedene ‚in-frame sense codons‘ (10.1039/C002256J) oder durch die Verwendung einer Kombination bestehend aus ‚sense-‘ und ‚nonsense-codons‘ (10.1002/cbic.201000586) in einem einzigen Translationszyklus durchzuführen. Damit bieten wir ein nicht nur für die chemische Biologie, sondern auch für andere Forschungsbereiche (einschließlich der Proteinchemie, Biophysik, Zellbiologie und Pharmakologie), interessantes methodologisches Werkzeug (Weitere Details finden Sie unter News aus den Jahren 2010 und 2011 auf unserer Website).  
 
8

Ma, Y., Biava, H., Contestabile, R., Budisa, N. & M.L. di Salvo. Coupling Bioorthogonal Chemistries with Artificial Metabolism: Intracellular Biosynthesis of Azidohomoalanine and its Incorporation into Recombinant Proteins.
Molecules, 2014, 19, 1004-1022.
 
Bakterien die mit toxischen Substanzen, wie z.B. Azide, „gefüttert“ werden, sind in der Lage intrazellulär die nicht nkAS Azidohomoalanin (Aha) zu produzieren. Dies ist ein wichtiger Ansatz, der es uns ermöglicht, biotechnologische Verfahren für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Protein-basierten Molekülen aus preiswerten und leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien zu entwerfen. Der Kern dieser Neuerung besteht aus einer sehr effizienten Kopplung der umprogrammierten Translation mit metabolischen Engineering, wodurch ein Weg für die Biosynthese der gewünschten nkAS konstruiert und in den Zellstoffwechsel eingebunden werden konnte. Auf diese Weise sind Wirtszellen in der Lage, gewünschte nkAS aus einfachen Kohlenstoffquellen zu erzeugen und diese direkt in das Zielprodukt einzubauen. Man muss in Betracht ziehen, dass moderne Methoden für den Einbau von nkAS nur für Experimente mit kleinem Maßstab gedacht sind. Das heißt, dass sie gut für akademische Fragestellungen geeignet sind, aber nicht für die Herstellung im industriellen Maßstab. Unsere Ergebnisse könnten auf einen Lösungswege (d.h. effiziente Kopplung der SPI mit metabolischem Engineering) für dieses Problem hindeuten.
 
9

Bohlke N, Budisa N. (2014). Sense codon emancipation for proteome-wide incorporation of noncanonical amino acids: rare isoleucine codon AUA as a target for genetic code expansion.
FEMS Microbiol Lett., 351, 133-144.
 
 
In diesem wissenschaftlichen Artikel berichten über die "Emanzipierung" aller 5797 seltene AUA-‚triplets‘ von der kanonischen Decodierung in E. coli. Dieses spektakuläre Ergebnis bildet eine solide Grundlage für den effizienten Einbau von nkAS, wobei die Wirksamkeit der herkömmlichen Sense-codon-Umwidmung-Methoden in der Regel durch konkurrierende, natürliche (kanonische) Aminosäure-Substrate limitiert werden. Die Codonempazipation bedeutet, dass genau diese Hindernisse effektiv beseitigt wurden. Die Sense-codon-Umwidmung hat eine große Bedeutung, da angenommen wird, dass zwischen 30 und 40 ‚sense-codons‘ ausreichend sind, um die genetische Information eines Organismus  zu kodieren. Das heißt, dass eine große Anzahl von ‚sense-codons‘ (> 20) für Umwidmungsexperimente zur Verfügung stehen sollte. In diesem Zusammenhang sollte der genetische Code im wesentlichen durch einen Proteomweiten Austausch durch eine Neuzuordnungen von ‚sense-codons‘ erweitert werden - das wäre ein großer Schritt in Richtung eines synthetischen Organismus (siehe auch: link bzw. link). Eine ‚sense-codon‘ Neuzuordnung mit nkAS umgeht mit Sicherheit alle bekannten Nachteile der auf der Suppression basierten Methoden (geringe Reproduzierbarkeit, ungünstiger Kontext beeinflusst das Auslesen Stop-Codons und nicht-Triplett-Codons etc.). Was die auf Suppression basierten Methoden betrifft, haben wir bereits kritische Aufsätze und Artikel (10.1371/journal.pone.0031992, 10.1002/anie.201005680) veröffentlicht. Daher sind wir fest überzeugt, dass der beste Weg, um diese Probleme zu umgehen, die  Fokussierung auf die Degeneration des genetischen Codes ist und dadurch eine Neuzuordnung von seltenen Codons zu erreichen. Solange wir dieses Ziel nicht erreichen, wird die Erweiterung des genetischen Codes das bleiben was sie jetzt ist: Eine interessante Erweiterung der klassischen rekombinante DNA-Technologie.  
 
10

Hoesl, M.G., Oehm, S., Durkin, P., Darmon, E., Peil, L., Aerni, H-R., Rappsilber, J., Rinehart, J., Leach, D., Söll, D. & Budisa, N.  Chemical evolution of a bacterial proteome.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015, 54, 10030-10034 
 
Mittels eines langzeit Evolutionsexperiments ist uns ein kompletter Austausch der naturlichen Aminosäure durch eine nkAS an 20899 Positionen im Proteom des Bakteriums Escherichia coli gelungen. Im genauen erreichten wir durch die quantitative Substitution von Tryptophan und durch ein Thienyl-Analoga eine wichtige Stufe auf dem Weg der chemischen Evolution zu einem synthetischen Bakterium. Im Allgemeinen könnte man die zeitgenössischen Methoden, die sich mit der Entwicklung des genetischen Codes beschäftigen, eher als Ausweitung der rekombinanten DNA-Technologie betrachten. Sie sind gut geeignet für Experimente mit Plasmiden für spezifische akademische Fragestellungen (z.B. Fluoreszenz-Tags, pharmakologischen Marker), aber ungeeignet für die Genom-weite Codonumwidmungen, die zu robuster künstliche Diversität in synthetischen Zellen führen sollte. In diesem Zusammenhang ist folgendes wichtig: Der genetische Code bedarf einer erheblichen Erweiterung durch einen Proteomweiten Austausch, da dies ein echter erster Schritt in Richtung eines synthetischen Organismus wäre. (Für weitere Einzelheiten siehe News von 2015 auf unserer Website)  

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